什么是PCR？

聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）是一種分子生物學技術，用于體外擴增特定的DNA片段。

PCR技術發(fā)展簡史

PCR之父 Kary Mullis

PCR反應基本原理和反應過程

基本原理：

反應過程：

變性——將被復制的DNA片段在高于其Tm的條件下（94~95℃）加熱，使DNA雙螺旋結構的氫鍵斷裂二解螺旋，形成兩條單鏈分子作為擴增反應的模板，以便與引物結合。

退火——將反應體系的溫度降至寡核苷酸（引物）的熔點溫度以下（40~70℃），以便使引物能與模板DNA序列互補結合，形成雜交鏈。

延伸——將反應體系的溫度升至72℃左右，此時反應體系按照模板鏈的序列以堿基互補配對原則以此把dNTP加至引物的3’端，在Taq DNA聚合酶的存在下，雜交鏈不斷延伸，直至形成新的DNA雙鏈。

以PCR為基礎的相關技術

● 逆轉錄PCR

提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA。

● 巢式PCR

對靶基因進行二次擴增，第二次擴增所用的模板為第一次擴增的產物。

● 多重PCR

在同一反應體系中加入多對引物，同時擴增一份DNA樣品中同一靶基因多個不同序列的片段或多個不同靶基因的片段。

● 單細胞PCR

單細胞PCR技術建立于1991年，研究者用膜片鉗技術成功地從單個細胞中獲取了細胞質，并以此為材料進行了RT-PCR用于神經例子通道的研究。

● PCR誘導定點突變

在PCR產物一端引入點突變，只需一對引物進行一次PCR擴增：用一條帶有限制性酶切位點（位點A）和預期突變的誘變引物（P1）和一條帶有另一個限制性酶切位點（位點B）的野生序列引物進行PCR擴增，由此獲得的擴增產物的P1端便帶有突變點。

● 原位PCR

直接法：使用標記（放射性同位素、生物素、地高辛、熒光素等）的引物或脫氧三磷酸核苷酸（如dUTP）進行PCR擴增，則標記物摻入到PCR產物中。最后用放射自顯影、免疫組化或熒光法檢測 PCR產物及其在細胞內位置。

間接法：先進行細胞內DNA的原位擴增，然后用標記的核酸探針進行原位雜交。

● 熒光定量PCR

在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。qPCR已經成為目前臨床基因擴增實驗室接受程度最高的技術，在各類病毒、細菌等病原微生物的鑒定和基因定量檢測、基因多態(tài)性分型、基因突變篩查、基因表達水平監(jiān)控等多種臨床實踐中得到大量應用。

● 數字PCR

通過將一個反應體系分成幾千到數萬個反應單元，并盡可能讓每個單元包含一個拷貝靶分子，進行PCR擴增后對各個反應單元的熒光信號進行統(tǒng)計學分析，是一種檢測反應終點熒光信號進行絕對定量的qPCR反應，而非以模板CT值進行核酸定量的real-timePCR，該技術具有超高的靈敏度與精密度。這項技術在極微量核酸樣本檢測、復雜背景下稀有突變檢測和表達量微小差異鑒定方面呈現(xiàn)出的優(yōu)勢已被普遍認可，而其在基因表達研究、microRNA研究、基因組拷貝數鑒定、癌癥標志物稀有突變檢測、致病微生物鑒定、轉基因成分鑒定、NGS測序文庫精確定量和結果驗證等諸多方面具有的廣闊應用前景已經受到越來越多的關注。

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